注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
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實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
氧化鑭(>99%,EP)LAMTOR4/C7orf59 (D4P6O) Rabbit mAb(R)-氨基四鹽酸鹽

化鎂六水(分子生物學(xué))SOD2 (D3X8F) XP® Rabbit mAbL-2,二氨酸

醋酸錳四水SOD2 (D3X8F) XP® Rabbit mAb阿替洛爾

錳屑(>99%,BR)Neurogenin 2 (D2R3D) Rabbit mAb-2-氟吡啶

錳粉(>99%,BR)Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (197G2) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjuga)-5-氟基酸

6-(馬來酰亞基)己酸琥珀酰亞酯VAMP1 Antibody鄰氧酸

神經(jīng)氨酸酶(≥10 units/ mg )PathScan® Phospho-Rb (Ser807/811) Sandwich ELISA Kit環(huán)匹羅司

酸鎳四水(>98%,BC)Phospho-Atg14 (Ser29) Antibody2-基-吡啶甲

尼羅紅(>95%,BS)NLRP3 (D2P5E) Rabbit mAb甲氫睪酮

N-基脲(>97%,BR)NT5E/CD73 (D7F9A) Rabbit mAbN,N'-撐雙硬脂酰

軟海綿酸(>95.0%,BC)S100A6 (D3H3W) Rabbit mAb氟-2-甲

軟海綿酸鈉(>95.0%,BC)CRABP1 (D7F9T) Rabbit mAb2-芐

鄰二甲酸酐(>98%.BC)Ingrin β3 (D7X3P) XP® Rabbit mAb甲基異喹啉

結(jié)晶碳酸(>98%,BR)Ingrin β3 (D7X3P) XP® Rabbit mAb1-環(huán)基-2-(2-氟基)酮

焦酸(>97%,BC)Phospho-GIT2 (Tyr592) (D6L1J) Rabbit mAb2-基酚鈉四水合物

鎢酸二水(>98%,BR)PREX1 (D8O8D) Rabbit mAb對溴基聯(lián)

對甲磺酰(>98%,BR)RBBP5 (D3I6P) Rabbit mAb5-甲基-硝基-1H-吡唑

硫酸奎寧水合物(>98%,BR)LC3A/B (D3U4C) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 555 Conjuga)-甲

紅細(xì)胞原卟啉(EP)ELISA試劑盒GABA  兔抗γ1氨基丁酸100 ul

紅細(xì)胞生成素受體(EPOR)ELISA試劑盒Gab1  接頭蛋白Gab 11 Kit

紅細(xì)胞生成素(EPO)ELISA試劑盒Phospho-Gab1 (Tyr627)  酸化接頭蛋白Gab 1100 ul

橫紋肌輔肌動蛋白α(sm Actinin-α )ELISA試劑盒Phospho-Gab1 (Tyr659)  酸化接頭蛋白Gab 1100 ul

亨廷頓相關(guān)蛋白1(HAP1)ELISA試劑盒Gab2  接頭蛋白Gab 2100 ul

黑色素細(xì)胞(MC Ab)ELISA試劑盒phospho-GAB2(Ser623)  酸化接頭蛋白Gab220 ul

黑色素濃縮激素(MCH)ELISA試劑盒phospho-GAB2 (Tyr452)  酸化接頭蛋白Gab 2100 ul

黑色素瘤相關(guān)抗原D4(MAGED4/MAGED4B)ELISA試劑盒phospho-GAB2 (Tyr643)  酸化接頭蛋白Gab2100 ul

黑色素瘤活性抑制蛋白(MIA)ELISA試劑盒phospho-GAB2 (Ser623)  酸化接頭蛋白Gab 2100 ul
牛結(jié)核病PCR檢測試劑盒規(guī)格交聯(lián)纖維蛋白二聚體抗體Ethopabate中文名：乙氧酰胺苯甲酯別名：分子式：C12H154

多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白DAT抗體Nicarbazin中文名：尼卡巴嗪別名：分子式：C19H18N6O6

核心蛋白聚糖抗體Ketoprofen中文名：酮基布洛芬別名：分子式：C16H14O3

多巴胺受體D3抗體Phenformin hydrochloride中文名：鹽酸苯乙雙胍別名：分子式：C10H16ClN5

誘捕受體3抗體Dinitolmide中文名：二硝托胺別名：分子式：C8H7N3O5
檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。