公司產(chǎn)品僅供科研使用，下列是產(chǎn)品屬性：

商品介紹：
MTT廣泛用于檢測細胞生長，其原理是MTT可以被活細胞線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成深紫色的formazan結(jié)晶，而死細胞則無此活性。深紫色的formazan結(jié)晶被溶解后可以通過測定490nm波長的光吸收而測定出其濃度，并由此推測出細胞的活力，細胞增殖越旺盛，則吸光度越高；細胞毒性越大，則吸光度越低。
產(chǎn)品特點：
1．采用*的Formazan溶解液，可以充分溶解formazan，減少誤差。
2．背景低，靈敏度高，線性范圍寬，重復(fù)性好。
3．本產(chǎn)品為足夠500次(5個96孔細胞培養(yǎng)板)微孔板檢測。
4．可用于生物活性因子活性檢測、抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性測定等。

存條件：低溫運輸、-20℃保存(但溶液B也可以常溫運輸和保存)，有效期一年。
使用方法：
下面操作是檢測細胞毒性的試驗，其他應(yīng)用跟此類似或更簡單(如生長曲線試驗)，操作步驟可以以此為基礎(chǔ)稍作修改即可，故不再贅述。
㈠、接種細胞
1．按常規(guī)消化法消化匯合的單層細胞，收集到含血清的培養(yǎng)基中。
2．200g離心5分鐘收集細胞沉淀。
3．用培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，制備成單細胞懸浮液并計數(shù)。
4．將細胞稀釋到2.5×103個/mL～5×10個/mL之間(需要根據(jù)細胞的生長速度決定)，如果不知道生長數(shù)度，一般可以稀釋到1×10個/mL。
5．將足夠量的細胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中(便于用排槍取樣)。一個96孔板的MTT檢測需要約20mL的細胞懸液。
6．用排槍在96孔板除的第2-11列各孔正中央加入200μL細胞懸液(對正常細胞)。如果是腫瘤細胞，則加入100μL腫瘤細胞懸液和100μL培養(yǎng)基(總體積為200μL)。注意：一定要把細胞加在孔的正中，否則細胞會聚集在孔的角落處，影響試驗。
7．用排槍在96孔板除的第1和第12各孔中加入跟細胞懸液等體積的培養(yǎng)基。第1 列各孔將作為+培養(yǎng)基-細胞+MTT對照(用于測OD時調(diào)零)，第12列加培養(yǎng)基的作用是減少邊緣效應(yīng)對第11 列反應(yīng)的影響。
8．按常規(guī)細胞培養(yǎng)方法在37℃和5% CO2條件下孵育1-3天，使細胞進入指數(shù)生長期。
㈡、藥物處理
9．用培養(yǎng)基將藥物稀釋到8個待測濃度(如果不知道待測濃度，則需要預(yù)試驗確定)，一般一種藥物需要做3塊平行板。
10．去除第2到第11列(共10列)各孔中的培養(yǎng)基(不要觸動細胞)，保留第1 列和第12列各孔中的培養(yǎng)基。
11．在第2和第11列(共2列)的各孔中加入200μL新鮮培養(yǎng)基，這些孔將作為+培養(yǎng)基+細胞-藥物的對照。
12．在第3到第10列(共8列)各孔中加入8個濃度梯度的待測藥物，每列加入一個濃度的藥物。
13．按常規(guī)方法把96孔板繼續(xù)放在在37℃和5% CO2條件下孵育一定的時間，此段時間即為藥物處理細胞的時間，由用戶自己決定。
14．處理結(jié)束后去除第2 到第11列(共10列，均含細胞)所有孔中的培養(yǎng)基，并再加入100μL新鮮培養(yǎng)基。
15．每天換培養(yǎng)使細胞數(shù)量擴增2-3倍(所需時間隨細胞不同而不同)。
㈢、存活細胞計數(shù)
16．在生長末期，去除第1到第11列各孔中的培養(yǎng)基后，再加入100μL新鮮培養(yǎng)基和10μL溶液A(含MTT成分)，用錫箔包裹住96孔板后放在37℃和5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-8小時。注意：溶液A在低溫情況下會凝固，使用前請室溫放置或20-25℃水浴至全部溶解，搖勻后使用。MTT有致癌性，一定要帶手套操作。
17．小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基(含溶液A)。由于培養(yǎng)基可能會影響光吸收，最好盡可能去除。
18．每孔加入100μL溶液B，置搖床上低速振蕩10分鐘，使MTT形成的formazan結(jié)晶物充分溶解。
19．由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，故需要立即在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇490nm測定吸光度。
?注意：用第1 列各孔(+培養(yǎng)基-細胞+MTT對照)調(diào)零。
20．計數(shù)同樣處理的各次重復(fù)的平均值。
21．以藥物濃度為橫軸，以吸光度為縱軸繪制曲線。由于各處理吸光度絕對值差別很大，一般需將其轉(zhuǎn)化成生長抑制率(以不加藥物的第2和第11列各孔數(shù)據(jù)的平均數(shù)作為100%)，這樣便于計算出IC50，用于各種藥物處理效果的比較。注意：如果測生長曲線，則以時間為橫軸。正常生長曲線一般呈現(xiàn)S型，具有促進作用的則斜率加大。

注意事項：
①加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
②使用干凈的塑料容器配置洗滌液。
③按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。
④底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。
⑤洗滌酶標板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應(yīng)孔中吸水。
⑥使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
⑦實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
⑧試劑應(yīng)按標簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標準品應(yīng)丟棄，不可保存。
⑨不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量
(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

人CD14分子(CDl4)ELISA試劑盒    人ELISA試劑盒    96T/48T    

人CD30分子(CD30)ELISA試劑盒    人ELISA試劑盒    96T/48T    

人chemerin ELISA試劑盒    人ELISA試劑盒    96T/48T    

人CX3C趨化因子受體1(CX3CR1)ELISA試劑盒    人ELISA試劑盒    96T/48T    

人CXC趨化因子配體16(CXCL16)ELISA試劑盒    人ELISA試劑盒    96T/48T    

人CXC趨化因子受體1(CXCR1)ELISA試劑盒    人ELISA試劑盒    96T/48T    

人CXC趨化因子受體3(CXCR3)ELISA試劑盒    人ELISA試劑盒    96T/48T    

人C多肽(CP) ELISA試劑盒    人ELISA試劑盒    96T/48T    

人C反應(yīng)蛋白(CRP)ELISA試劑盒    人ELISA試劑盒    96T/48T    

XY-E11196    人ELISA試劑盒    96T/48T    

人C肽(C-Peptide)ELISA試劑盒    人ELISA試劑盒    96T/48T    

人C型鈉尿肽(CNP)ELISA試劑盒    人ELISA試劑盒    96T/48T    

人C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族4成員E(CLEC4E)ELISA試劑盒    人ELISA試劑盒    96T/48T    

人D-乳酸脫氫酶(D-LDH) ELISA試劑盒      人ELISA試劑盒    96T/48T    

人Dickkopf 1(DKK1)ELISA試劑盒    人ELISA試劑盒    96T/48T    

人D二聚體(D2D)ELISA試劑盒    人ELISA試劑盒    96T/48T    

人EB病毒IgA(EBv IgA)ELISA試劑盒    人ELISA試劑盒    96T/48T    

人EB病毒IgG(EBv IgG)ELISA試劑盒    人ELISA試劑盒    96T/48T    

人EB病毒IgM(EBv IgM)ELISA試劑盒    人ELISA試劑盒    96T/48T    

人EJ抗體/抗甘氨酰tRNA合成酶抗體(EJ/GlyRS)ELISA試劑盒      人ELISA試劑盒    96T/48T    

人E鈣粘著蛋白/上皮性鈣黏附蛋白(E-Cad)ELISA試劑盒    人ELISA試劑盒    96T/48T    

人E選擇素(E-Selectin/CD62E)ELISA試劑盒      人ELISA試劑盒    96T/48T    

人α-內(nèi)肽(α-EP)ELISA試劑盒    人ELISA試劑盒    96T/48T    

人α/β干擾素受體(IFN-α/βR)ELISA試劑盒      人ELISA試劑盒    96T/48T    Caspase 9 活性檢測試劑盒    

Caspase抑制劑(Z-VAD-FMK)    

Caspase 3抑制劑(Ac-DEVD-CHO)    

線粒體膜電位檢測試劑盒    

羅丹明123    

CFDA SE細胞增殖與示蹤檢測試劑盒    

細胞增殖示蹤熒光探針(CFDA SE)    

Ad-GFP-LC3B    

Ad-mCherry-GFP-LC3B    

DAPI溶液(5mg/ml)    

DAPI染色液    

Hoechst 33258細胞藍色熒光染料    

Hoechst 33258染色液    

Hoechst 33342細胞藍色熒光染料    

Hoechst 33342染色液    

活細胞染色液(Hoechst 33342)(100×)    

細胞活力檢測試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)    

碘化丙啶    

Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒    

細胞周期與凋亡檢測試劑盒    

Alexa Fluor 488/PI細胞凋亡檢測試劑盒    

Annexin V-PE/7-AAD凋亡流式檢測試劑盒    

Annexin V-EGFP/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒    

Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒    

Annexin V-PE細胞凋亡檢測試劑盒    

MTT檢測試劑盒Annexin V-PE/7-AAD雙染細胞凋亡檢測試劑盒    

Annexin V-APC細胞凋亡檢測試劑盒    

Annexin V-APC/7-AAD雙染細胞凋亡檢測試劑盒    

操作程序：

注意：最重要的是及時固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對mRNA的分解作用。此外，過度固定對原位雜交有明顯的不利影響。

1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。

2．細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養(yǎng)，條件為37℃和5%的CO2，所用培養(yǎng)基為Dulbecco基礎(chǔ)培養(yǎng)基。細胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。

3．培養(yǎng)細胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。

4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。

5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。

6.后固定：消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。

7．預(yù)雜交：濕盒的準備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預(yù)雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時。吸取多余液體，不洗。

8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。

9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復(fù)0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。

10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗

11.滴加化鼠抗*：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。

12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。

13.滴加化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。

14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。

15.必要時蘇木素復(fù)染，充分水洗。

16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。